近日，生物工程学院、生物反应器工程全国重点实验室周胜敏课题组在Nucleic Acids Research 发表题为“Dual-single-guide-RNA Strategy Improves CRISPR-Mediated Homology-Directed Repair in Aspergillus” 的研究论文。该研究系统阐明了限制CRISPR 精准敲入效率的关键 DNA 修复机制，并提出了一种具有普适性的高效 HDR 设计策略，为基因编辑中插入位点依赖性强、目标片段难以高效敲入这一普遍问题，提供了可预测、可推广的解决方案。
CRISPR-Cas9 是当前最重要的基因组编辑技术之一，可在sgRNA的引导下于基因组特定位点产生双链断裂，并借助细胞内 DNA 修复通路实现基因改造。对于外源序列的精准插入（knock-in），通常依赖同源定向修复（homology-directed repair, HDR）。然而，在真菌等体系中，HDR 效率常受到切割位点位置、插入片段长度以及修复通路竞争等多重因素制约，导致部分插入位点长期存在“难以敲入”的问题，缺乏清晰的机制解释和可预测的设计原则。
图片说明：CRISPR 精准敲入的结构性限制及双 sgRNA 提升效率的原理示意
本研究从DNA 修复过程中的空间几何约束出发，揭示供体 DNA 与染色体链侵入路径之间的几何错位，是导致同源定向修复介导精准敲入效率下降的关键原因。研究解析了同源重组相关蛋白在双链断裂周围的方向性加载规律，明确了有效修复窗口的空间特征。在此基础上，提出“双向切割”形成“几何对齐窗口”的设计策略，通过在目标位点两侧引入成对切割，实现供体同源臂与内源 DNA 修复路径的空间匹配，从而稳定提升精准敲入效率。该策略在不同插入片段长度及多类编辑任务中均表现出良好适用性，并可推广应用。该研究为长期存在的位点依赖性精准敲入难题提供了机制解释和可操作的设计原则。
该论文第一作者为生物工程学院硕士研究生富明鑫，通讯作者为生物反应器工程全国重点实验室周胜敏副教授。本研究得到了国家自然科学基金等项目的支持。
原文链接：https://academic.oup.com/nar/article/54/4/gkag095/8462613?login=false
